基因型

F- ompT hsdSB(rB- mB- ) gal dcm rne131 (DE3)pLysS(CamR)

簡(jiǎn)要說(shuō)明

BL21Star(DE3)pLysS 菌株來(lái)源于BL21(DE3)，含有rne131突變（RNaseE基因），RNaseE 基因的突變降低了內(nèi)源RNase的積累，增強(qiáng)菌株細(xì)胞內(nèi)mRNA 的穩(wěn)定性，從而提高異源蛋白的表達(dá)水平。主要適用于T7 啟動(dòng)子表達(dá)載體(如pET系列)的高水平蛋白表達(dá)，同時(shí)含有大腸桿菌 RNA聚合酶，也可用于非T7啟動(dòng)子表達(dá)載體（pGEX，pMAL等）的蛋白表達(dá)。由于BL21 Star(DE3)菌株的異源基因基礎(chǔ)表達(dá)水平較高，所以不適合毒性蛋白的表達(dá)。BL21 Star(DE3)pLysS 菌株攜帶pLysS 質(zhì)粒，具有氯lu素抗性。pLysS 含有表達(dá) T7溶jun酶的基因，T7溶jun酶可以作用于大腸桿菌細(xì)胞壁上的肽聚糖溶解大腸桿菌，還可與T7RNA聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾IPTG 誘導(dǎo)的表達(dá)。pLysS 質(zhì)粒含有p15A復(fù)制起始子，可以和含有 pUC或 pBR322 等復(fù)制起始子的質(zhì)粒兼容。BL21 Star(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率達(dá)107 cfu/μg DNA。

操作說(shuō)明

1、BL21 Star(DE3)pLysS 感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的質(zhì)粒并用手拍EP管底輕輕混勻，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激 45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

 3. 向離心管中加入700 μl不含抗生素的無(wú)菌2YT或LB培養(yǎng)基，混勻后37℃， 200 rpm 復(fù)蘇60 分鐘。

4.5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。-

注意事項(xiàng)

1、感受態(tài)細(xì)胞最好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。

3. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4. 誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度可選（0.1-2mM 均可）。

5. 為獲得需要量的蛋白，最佳誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化6. BL21 Star(DE3)pLysS 菌株攜帶pLysS質(zhì)粒，除復(fù)蘇培養(yǎng)基為無(wú)抗生素外，其余所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)液均應(yīng)含有34µg/ml氯lu素，以防質(zhì)粒丟失。